眾所周知，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合在基因啟動(dòng)子區(qū)域調(diào)控基因的表達(dá)，是基因表達(dá)量改變最重要的調(diào)控方式。那轉(zhuǎn)錄因子與靶基因之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系便成為研究的重點(diǎn)。當(dāng)我們的研究鎖定了靶基因，但是不知道是哪些轉(zhuǎn)錄因子參與了調(diào)控的時(shí)候該如何研究呢？之前的文章給大家介紹過《啟動(dòng)子的查找以及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測》，今天我們來介紹一下如何通過實(shí)驗(yàn)手段找到靶基因上游的轉(zhuǎn)錄因子——以DNA為中心的互作檢測手段。

DNA pull down 技術(shù)是體外研究DNA 與蛋白質(zhì)互作的有力工具。該技術(shù)針對(duì)目標(biāo)區(qū)域設(shè)計(jì)特異性DNA 探針并經(jīng)過脫硫生物素標(biāo)記，脫硫生物素探針可以和偶聯(lián)在磁珠上的鏈霉親和素親和結(jié)合。然后，細(xì)胞核提取物與磁珠-DNA 探針孵育，作用蛋白質(zhì)分子可以和DNA 探針特異性結(jié)合；經(jīng)過洗滌可以將非特異性結(jié)合蛋白質(zhì)去除；最后，經(jīng)洗脫液洗脫，得到目的DNA 探針-蛋白質(zhì)復(fù)合物，再經(jīng)過Western Blot 或質(zhì)譜（MS）鑒定蛋白質(zhì)類型。其原理圖：

DNA pulldown原理圖

• 實(shí)驗(yàn)流程：

對(duì)于研究的啟動(dòng)子靶標(biāo)區(qū)域沒具體預(yù)測區(qū)域，一般針對(duì)基因上游2000bp序列設(shè)計(jì)引物，并標(biāo)記上生物素作為DNA pull down的探針。

Yeast One Hybrid（酵母單雜交）技術(shù)最早是從酵母雙雜交技術(shù)發(fā)展而來，通過對(duì)報(bào)告基因的表型檢測，分析DNA與蛋白之間的相互作用，以研究真核細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)調(diào)控。

真核生物基因的轉(zhuǎn)錄起始需轉(zhuǎn)錄因子參與，轉(zhuǎn)錄因子通常由一個(gè)DNA特異性結(jié)合功能域和一個(gè)或多個(gè)其他調(diào)控蛋白相互作用的激活功能域組成，即DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA-bindingdomain BD）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（activationdomain，AD）。用于酵母單雜交系統(tǒng)的酵母GAL4蛋白是一種典型的轉(zhuǎn)錄因子，GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域靠近羥基端，含有幾個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位點(diǎn)（UGS），而轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可與RNA聚合酶或轉(zhuǎn)錄因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。在這一過程中，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可完全獨(dú)立地發(fā)揮作用。據(jù)此，我們可以將GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域置換為轉(zhuǎn)錄因子編碼基因，將順式作用元件與基本啟動(dòng)子（minimal promoter, Pmin）和報(bào)告基因連接。只要轉(zhuǎn)錄因子能與目的DNA元件相互作用，即可通過轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域激活RNA聚合酶，啟動(dòng)子下游報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。原理圖：

• 實(shí)驗(yàn)流程：

下面讓我們來看一下2種技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用案例吧。

• 研究介紹：

根瘤菌在豆科植物根瘤細(xì)胞內(nèi)的共生固氮作用減輕了對(duì)氮肥的需求。固氮過程需要內(nèi)共生菌分化為可逆或終端的類菌體。后者受植物控制，更有益且已在豆科植物的多個(gè)類群中演化。倒置重復(fù)缺失類群豆科植物（IRLC）的植物效應(yīng)子是根瘤特異性富含半胱氨酸（NCR）肽，而在像大豆這樣的非終端分化豆科植物中不存在。先前認(rèn)為NCRs與特定轉(zhuǎn)錄因子共同演化，但作者的研究表明NCR基因的表達(dá)并不需要NCR特異性轉(zhuǎn)錄因子。將苜蓿的NCR169基因在其自身啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下引入大豆根部，結(jié)果在根瘤中特異性表達(dá)，導(dǎo)致與終端分化相關(guān)的細(xì)菌體變化。研究者們利用酵母單雜交和DNA pull down鑒定出了來自苜蓿和大豆根瘤的兩個(gè)AT-Hook Motif Nuclear Localized（AHL）轉(zhuǎn)錄因子，它們能夠結(jié)合NCR169啟動(dòng)子中的AT豐富序列，誘導(dǎo)其表達(dá)。雖然NCR169的突變在晚期階段阻止了類菌體發(fā)育，但MtAHL1或MtAHL2的缺失完全阻止了類菌體分化，表明它們還調(diào)節(jié)其他NCR基因，這些基因?qū)τ诘�固定根瘤的發(fā)育至關(guān)重要。在非-IRLC豆科植物中，同源轉(zhuǎn)錄因子對(duì)NCRs的調(diào)節(jié)為提高缺乏NCRs的豆科植物的氮固定效率提供了可能性。

在Y1H文庫篩選(1181 bp)和DNA pulldown(382 bp)中鑒定出的NCR169啟動(dòng)子區(qū)相互作用的蛋白質(zhì)

酵母單雜交(Y1H)檢測NCR169 1181bp啟動(dòng)子區(qū)域與MtAHL 1、MtAHL2、GmAHL1或GmAHL2的結(jié)合

• 研究介紹：

進(jìn)行性蛋白尿是糖尿病腎病(DN)的早期臨床特征之一。在本研究中，研究者們使用了JASPAR數(shù)據(jù)庫和DNA pulldown結(jié)合LC-MS來確定DN中DLX6-AS1的潛在調(diào)節(jié)因子，隨后進(jìn)行的雙熒光素酶報(bào)告基因分析和染色質(zhì)免疫沉淀證實(shí)了結(jié)合位點(diǎn)。此外，研究者們還在db/db小鼠模型和培養(yǎng)的人類足細(xì)胞中研究了調(diào)節(jié)因子對(duì)DN進(jìn)展的影響。通過這些方法的分析，研究者們鑒定出了一些可能的DLX6-AS1調(diào)節(jié)因子。這些調(diào)節(jié)因子可能通過與DLX6-AS1的特定結(jié)合位點(diǎn)相互作用，影響其表達(dá)水平。在db/db小鼠模型和培養(yǎng)的人類足細(xì)胞中，這些調(diào)節(jié)因子對(duì)DN的進(jìn)展產(chǎn)生了影響。總的來說，本研究揭示了DN中DLX6-AS1的一些潛在調(diào)節(jié)因子，為理解DN的發(fā)病機(jī)制和尋找治療靶點(diǎn)提供了新的線索。

轉(zhuǎn)錄因子CREB參與了DLX6-AS1的上調(diào)

• 研究介紹：

YSL1和YSL3在葉子、花粉和發(fā)育中的種子中運(yùn)輸金屬-尼古丁胺（NA）復(fù)合物，并在調(diào)節(jié)種子發(fā)育和成熟階段的鐵（Fe）積累中起重要作用。然而，它們的基因轉(zhuǎn)錄水平如何調(diào)節(jié)尚不清楚。在這項(xiàng)研究中，研究者使用酵母單雜交篩選鑒定出轉(zhuǎn)錄因子WRKY12，它在擬南芥中直接調(diào)節(jié)YSL1和YSL3基因的轉(zhuǎn)錄水平。WRKY12與YSL1和YSL3具有相反的表達(dá)模式，wrky12突變體對(duì)Fe缺乏具有耐受性，而WRKY12過表達(dá)系對(duì)Fe缺乏敏感。在種子發(fā)育和成熟過程中，WRKY12可以直接結(jié)合YSL1和YSL3的啟動(dòng)子并抑制它們的表達(dá)。遺傳分析表明，WRKY12在種子發(fā)育和成熟階段的Fe攝入中位于YSL1和YSL3的上游。總之，該研究的結(jié)果表明，WRKY12通過抑制YSL1和YSL3的表達(dá)，負(fù)調(diào)控植物種子中的鐵攝入。

酵母單雜交法篩選YSL1和YSL3調(diào)控基因

酵母單雜交和DNA pulldown是兩種用于識(shí)別目標(biāo)基因與轉(zhuǎn)錄因子相互作用的方法。兩種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，在實(shí)際應(yīng)用中，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蜆悠诽攸c(diǎn)選擇合適的方法。在某些情況下，可以結(jié)合這兩種方法以提高結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

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