近日，華中師范大學邱保勝教授團隊在《Nature Communications》發表題為“Phosphorus deficiency alleviates iron limitation in Synechocystis cyanobacteria through direct PhoB-mediated gene regulation”文章，其重點研究了Synechocystis藍藻轉錄因子PhoB在對于磷/鐵的營養元素限制的調控機制，構建了這兩種元素的同時發生變化的代謝調控網絡。

1.研究背景

鐵（Fe）和磷（P）作為所有生物體所需的必需養分，參與一系列生理生化反應及生物代謝過程。最近的研究表明鐵和磷的限制會同時發生，在低緯度海洋和淡水生態系統的大片區域以及陸地土壤環境中都存在這種鐵/磷的同時出現缺乏。然而，目前對于鐵/磷共限制環境中的生物體的適應性研究相對較少，有其是此過程基因調控機制。

2.研究思路

3.研究背景

研究首先對Fe/P單獨與同時缺乏培養條件下藍藻6803的生長以及相應物質積累情況進行了觀察。正如預期，單獨的Fe缺乏(−Fe+P)會強烈阻礙藍藻的生長（圖1a-d）。然而，缺磷明顯減輕了這種影響。藍藻細胞在Fe/P共同缺乏的情況下比在僅Fe缺乏的生長快15%（圖 1d）。培養4天后，-Fe-P條件下積累的生物量比-Fe+P條件下積累的生物量更多（圖1c）。

同時，觀察Fe限制誘導標志基因(isiA)和P限制誘導標志基因(pstS、pstS2)。在共限培養物觀察到的葉綠素吸收光譜變化與IsiA基因表達情況一致（圖1e）。-Fe-P處理的細胞光合性能顯著高于-Fe+P（圖1f）。總體而言，這些結果一致表明，P缺乏減輕了Fe缺乏情況下藍藻的生長抑制。顯微鏡檢查（圖1g）和流式分析都表明在任何實驗條件下細胞大小都沒有顯著變化，這意味著此種調控機制與細胞大小無關。

圖1磷缺乏促進了鐵限制藍藻的生長

先前的工作表明，-Fe/-P條件下ROS的大量積累會對藍藻的光合活性產生嚴重影響。檢測總ROS水平發現-Fe-P細胞的ROS含量比-Fe+P細胞降低了75%（圖2a），表明缺鐵條件下低磷誘導了ROS清除活性增強。qRT-PCR 分析表明，幾個參與 ROS 清除的基因在-Fe−P條件下比-Fe+P條件下表達更高。在差異表達的基因中，含鐵超氧化物歧化酶（SOD）編碼基因sodB上調最多。進一步分析發現，+Fe−P和−Fe−P樣品中sodB的表達顯著上調（圖2b），表明P缺乏增強了sodB的表達。使用凝膠內活性染色的 SOD 測定進一步支持了這個結論（圖 2c、d）。藍藻SOD 活性因 Fe 饑餓而急劇降低，而在 P 缺乏時則出現增加（圖2d）。SOD的活性增強可能是Fe/P 聯合集胞藻中 ROS積累減少的原因。

圖2  在磷缺乏的情況下sodB 基因表達增強

實驗室環境下實驗結果表明，在鐵充足和缺乏的條件下，缺磷都會誘導 sodB 表達，因此作者檢測海洋水體環境下藍藻的 sod 基因表達否也隨營養元素變化而變化。SOD 存在四種亞型，每種亞型具有不同的金屬輔因子。只有sodB 使用Fe作為其蛋白結構輔因子。全球海洋 TARA 宏基因組數據集中 sod 的分布模式表明，sod 廣泛存在于在不同水平的磷酸鹽 (Pi)生物利用度下的物種之中 (圖 3a)。宏轉錄組分析顯示，不同sod亞型的表達在低Pi區域富集（圖 3a）。考慮到海洋磷循環的復雜性，接下來對sods轉錄物與磷限制生物標志物pstS的相對水平，結果顯示它們的豐度之間呈現正相關（圖3b）。這些結果表明，海洋中缺磷會增強sods 的表達，這可能是藍細菌的常見反應機制。

圖3 sods在海洋生態系統中分布情況

為了探討sod對鐵限制藍藻生長的影響，分別在存在和不存在甲基紫精（MV）的情況下進行了耐氧實驗。如圖4所示，Fe限制的藍藻對O₂⁻ 脅迫高度敏感。與沒有MV相比較，-Fe+P 樣品的光合電子傳輸速率 (ETR) 在 O₂⁻誘導劑存在下顯著降低(圖4a)。與 MV 一起孵育 8 天后，−Fe+P 樣品的 ETR 幾乎檢測不到。相反，當缺磷與-Fe同時發生時，Fe限制細胞（-Fe-P）對O₂⁻的抵抗力明顯增強（圖4a）。流式結果也觀察到類似的結果（圖 4b）。這些結果表明，缺磷可以進一步增強鐵限制藍藻的O₂⁻耐受性。

圖4 缺磷可以增強鐵缺乏情況下藍藻對O₂⁻耐受性

為了探究在 Fe/P 共限制下誘導 sodB 表達的調控機制，使用酵母單雜交 (Y1H) 系統篩選sodB 啟動子互作相關蛋白，OmpR 家族轉錄因子 PhoB 被確定為假定的調節因子（圖 5a）。生信分析結果顯示PhoB 結合基序位于sodB 的啟動子區域，且凝膠電泳遷移實驗EMSA結果也進一步證實 PhoB 和 sodB 啟動子之間的互作關系（圖 5b）。PhoB 是一種轉錄激活因子，已知可在低環境 Pi 濃度下控制磷相關基因的表達，但PhoB激活 SOD 基因表達的功能此前尚未得到確定。

為了評估PhoB在sodB基因表達中的調節作用，通過插入失活來敲除phoB基因。如圖5c所示，在phoB突變體中sodB的表達顯著降低。在-Fe-P條件下，野生型（WT）中sodB的轉錄水平增加了5.8倍，而在phoB 突變體中只有2.8倍的增加。phoB 突變體中殘留的 sodB 誘導可能是由于轉錄因子 RpaB，它是氧化應激反應中已知的調節因子。且在 Y1H 文庫篩選測定中也發現 RpaB 與 sodB 啟動子存在相互作用。進一步分析發現，−Fe-P 情況下WT中的細胞內ROS含量僅為-Fe+P下的26％，而在phoB突變體中為80％（圖5d）。sodB誘導的減少顯著降低了−Fe-P的藍細菌的MV耐受性（圖5e）。O₂⁻耐受性測定表明，當phoB被敲除時，磷缺乏不再能增強-Fe藍細菌的O₂⁻抵抗力，并且-Fe-P細胞表現出類似于-Fe+P細胞的反應（圖5e）。作者在藍藻細胞（SodB-OE 菌株）中過表達 sodB，以探索 sodB 在 ROS 穩態中的作用。考慮到 sodB 是 Fe 依賴性的，這種金屬酶的高表達可能會增加細胞對 Fe 的需求，導致更嚴重的 Fe 缺乏和更緩慢的生長。總而言之，這些結果一致表明，PhoB 介導的 sodB 表達對于在−Fe−P 條件下維持 ROS 穩態至關重要。

圖5 轉錄因子 PhoB 調控sodB表達

通過Y1H（圖6a）和EMSA測定（圖6b）驗證了PhoB和鐵選擇性孔蛋白slr1908啟動子之間的特異性相互作用。qRT-PCR結果分析表明，在WT中，slr1908的轉錄水平受到磷缺乏的強烈誘導，在+Fe−P和−Fe−P條件下分別上調7.5倍和4.6倍（圖6c）。然而，slr1908 的表達在 phoB 突變體中顯著降低（圖 6c）。由于slr1908 的完全敲除突變體不可用，因此在敲低（KD）突變體中評估了 slr1908 在 Fe/P 共限制下的生理作用。與WT相比，slr1908KD菌株的生長在-Fe+P條件下顯著被抑制（圖6d），這與該基因在Fe吸收中的重要作用相一致。與 Fe 限制條件相比，slr1908KD 菌株的生長在 Fe/P 共同限制下并未增強。−Fe−P的slr1908KD菌株的生長速率和細胞密度甚至低于-Fe+P條件下的生長速率和細胞密度（圖6d）。此外，slr1908的過度表達顯著提高了Fe限制藍藻的生長速率，表明slr1908誘導在適應Fe限制中發揮著關鍵作用。鑒于PhoB在低磷反應中的重要作用，此次研究結果表明 PhoB 還促進Fe的吸收，并在Fe和P 穩態之間的串擾中發揮重要作用。

圖6 PhoB調節slr1908表達

當 phoB 失活時，缺磷對鐵限制生長的積極作用大大減弱（圖7a），證實了PhoB 介導的轉錄調控在 Fe/P 共限制反應中的重要性。利用系統發育足跡分析對 PhoB 靶基因的啟動子區域基序進行驗證從而鑒定 PhoB 介導的全基因組基因調控，得到的該基序與之前報道的pho box共有序列一致，核心序列（TTAA）高度保守。EMSA 測定表明，這三個 TTAA 序列中任何一個的突變都會顯著降低或消除 PhoB 的 DNA 結合能力，表明這三個串聯重復序列對于 PhoB 的識別至關重要。

根據核心基序的序列，鑒定出211個啟動子含有潛在的 PhoB 結合位點。其中，92個潛在靶基因在Fe充足或缺乏條件下因P缺乏而上調（FC≥1.5，P值≤0.05）。PhoB染色質免疫沉淀測序 (ChIP-seq) 結果進一步驗證此結果，這92個基因中的60個在ChIP-seq 結果中得到富集。除了眾所周知的控制磷酸鹽同化作用外，新發現的PhoB 靶標還包括與應激反應、光合作用和四吡咯代謝相關的基因。其中有sll1552，該基因位于I型分泌系統編碼基因slr1651的上游，方向相反，可能與下游酰基轉移酶基因sll0720和RTX（毒素中重復）蛋白基因sll0721形成外毒素生物合成簇（圖7b）。轉錄組數據（圖 7c）和 qRT-PCR 分析表明，該簇中的所有基因均在缺磷的條件下表達升高。它們在phoB 突變體中的表達顯著降低。通過EMSA實驗進一步驗證了PhoB與其啟動子之間的相互作用（圖7d）。此實驗結果進一步支持了 PhoB 對 sll1291 簇的調節作用（圖 7e）。

圖7 轉錄因子PhoB調控趨化性和外毒素相關基因

本研究首先是對Fe/P單獨與共缺乏培養條件下藍藻的生長及生理相關指標進行檢測，提出問題：P缺乏對于Fe缺乏的條件下藍藻的抑制生長有一定的恢復，但是機制不明。接下來檢測到細胞內ROS發現，發現-Fe-P細胞的ROS含量比-Fe+P細胞低，進一步考慮驗證是對O₂^-的抵抗，鎖定sodB （Fe作為其蛋白結構因子）為關鍵調節因子。酵母單雜Y1H篩選sodB 啟動子互作相關蛋白為OmpR 家族轉錄因子 PhoB，進一步EMSA和ChIP-seq實驗驗證PhoB對sodB 啟動子結合和調控，且PhoB還調節參與鐵選擇性孔蛋白slr1908表達，以及趨化性和外毒素分泌的基因，從而構建Fe/P共限制情況下調控網絡模型（圖8）。

圖8 phoB介導的鐵/磷共限調控網絡模型

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