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項目文章（J Hepatol&IF:26.8）| CUT&Tag+轉錄組解析組蛋白新型修飾H3Q5ser調控HCC的發生機制肝細胞癌（HCC）是一種侵襲性惡性腫瘤，缺乏有效的治療選擇。由于進展迅速和治療耐藥，HCC患者的長期生存率并不理想。繼續探索HCC進展的分子機制和確定新的靶向治療方法以改進現有的治療策略仍然非常重要。神經遞質5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）也就是血清素，在肝癌細胞的免疫調節、血管生成、增殖和轉移中起著至關重要的作用，然而其調控機制仍不明確。2019年3月，一篇Nature的文章發現5-HT能夠通過TGM2調控H3Q5ser影響大腦神經元分化和發育。而5-HT與TGM2作為肝細胞癌中可能的促進因子，兩者關聯以及影響H3Q5ser參與的調控機制需要被進一步研究。 近日，華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院肝臟外科的陳孝平院士、張必翔教授、張學武研究員在頂刊Journal of Hepatology（IF:26.8）發表了題為“TGM2-mediated histone serotonylation promotes HCC progression via MYC signalling pathway”的研究論文。研究發現TRIM28介導TGM2向MYC募集，促進H3Q5ser修飾MYC靶基因，從而促進HCC進展。此外，靶向TGM2轉谷氨酰胺酶活性并與索拉非尼協同，具有作為HCC治療方案的潛力。愛基百客Igenebook為該研究提供了CUT&Tag以及轉錄組的技術服務，協助尋找調控關鍵靶點。
圖1 TGM2調控介導模型 IGENEBOOK 研究結果 一、5-HT在HCC腫瘤組織中積累 為了評估HCC中的色氨酸代謝水平，作者分析了已發表的數據集，并證明主要的分解代謝途徑犬尿氨酸（Kyn）途徑在HCC中受到抑制。此外，與鄰近的非腫瘤組織相比，HCC組織中色氨酸羥化酶1（TPH1，外周組織中5-HT合成的限速酶）的表達升高，提示HCC中Trp代謝的5-HT通路可能比鄰近非腫瘤組織更活躍。 為了評估5-HT的攝取，作者測量了來自同濟隊列1的血清5-HT濃度，結果顯示與健康供者相比，HCC患者的5-HT水平顯著升高。此外，血清素轉運體SERT和ENT4在腫瘤組織中高表達。負責降解5-HT的單胺氧化酶A（MAOA）在同濟隊列2的腫瘤組織中表達水平較低。此外，同濟隊列中人類HCC組織中的5-HT濃度遠高于鄰近非腫瘤組織。總的來說，與非腫瘤組織相比，5-HT在HCC組織中通過內源性合成和外源性攝取積累。
圖2 5-HT在HCC腫瘤組織中升高 二、TGM2水平升高預示HCC預后不良 TGM2可以通過5-HT介導蛋白質的5-羥色胺化，這一過程被歸類為一種單胺化。為了確認TGM2在HCC中的表達模式，作者對HCC和鄰近非腫瘤組織進行WB和HE染色。結果顯示，與鄰近非腫瘤組織相比，TGM2在HCC組織中的表達升高。此外，HCC組織中H3Q5ser水平也較高，并與TGM2表達相關。特別是H3K4me3Q5ser的修飾水平可能同時受到H3Q5ser和H3K4me3修飾改變的影響。由于H3Q5ser的豐度較低，在HCC組織中無法直接檢測到H3Q5ser抗體。因此，作者測量了H3K4me3和H3K4me3Q5ser的水平，將標準化的H3K4me3Q5ser水平（相對于H3K4me3）作為H3Q5ser水平的間接指標。對臨床樣本的總生存期（OS）和無病生存期（DFS）研究發現，TGM2表達較高的患者的OS和DFS較差，且TGM2表達與AFP水平升高、腫瘤分化較差、BCLC分期較晚呈正相關。較高的TGM2表達是較短OS和DFS的獨立危險因素。綜上所述，這些結果表明TGM2表達升高預示著較差的預后。
圖3 TGM2的高表達與HCC的進展有關 三、在體外和體內，核定位的TGM2促進HCC的癌變和進展 為了確定TGM2在HCC癌變和進展中的功能，作者測量了7種肝癌細胞系中TGM2的核和細胞質蛋白水平，并建立了TGM2敲低和核特異性過表達的細胞系，隨后，作者進行了CCK-8和集落形成實驗來評估HCC細胞的增殖，Transwell和傷口愈合試驗來評估HCC細胞的遷移和侵襲能力。結果顯示，TGM2過表達可顯著促進體外HCC細胞的增殖、遷移和侵襲；同樣，TGM2過表達可顯著促進皮下異種移植小鼠模型中HCC細胞的生長。此外，在HTVI模型中，TGM2促進了HCC的癌變和進展。這些結果表明，TGM2，特別是核定位的TGM2，在體外和體內促進HCC的癌變和進展。
圖4 在小鼠模型中，Tgm2缺乏抑制HCC進展 四、TGM2通過其轉谷氨酰胺酶活性介導的H3Q5ser修飾促進HCC進展 TGM2是谷氨酰胺轉胺酶家族的一員，以其谷氨酰胺轉胺酶活性而聞名。核定位的TGM2與H3Q5ser修飾密切相關。為了研究其轉谷氨酰胺酶活性介導的H3Q5ser修飾在HCC進展中的作用，作者通過CRISPR-Cas9系統特異性敲除了TGM2，隨后建立了過表達野生型TGM2或轉谷氨酰胺酶活性缺陷突變變體（W241A）的HCC細胞系（兩者都用核定位信號（NLS）標記），以及過表達野生型組蛋白H3.3和突變體（Q5A和Q5E）的HCC細胞系。CCK-8、集落形成實驗以及皮下異種移植小鼠模型表明，谷氨酰胺轉胺酶活性完整的TGM2過表達HCC細胞表現出最快的增殖。當H3.3在5位突變時，體外球體形成以及皮下異種移植小鼠模型中的腫瘤形成受到抑制。隨后，作者在TGM2條件敲除（CKO）小鼠中建立了小鼠野生型TGM2或突變變體（W241A）模型的肝臟特異性過表達。HTVI實驗表明TGM2過表達且谷氨酰胺轉胺酶活性完好的模型腫瘤形成量最大，生存率最低。且突變5號位置的H3.3能夠抑制腫瘤形成，提高生存率。總體而言，這些發現表明TGM2通過轉谷氨酰胺酶活性介導的H3Q5ser修飾促進HCC進展。
圖5 TGM2轉谷氨酰胺酶活性介導的H3Q5ser修飾在體內促進HCC進展 五、H3Q5ser修飾增強MYC靶基因的轉錄 為了系統地研究TGM2介導的H3Q5ser修飾如何促進HCC進展，作者對H3K4me3和H3K4me3Q5ser進行了CUT&Tag測序，以分析它們在TGM2轉谷氨酰胺酶活性抑制劑GK921處理的MHCC-97H細胞中的分布。測序分析顯示，H3Q5ser修飾主要分布在啟動子區域。抑制TGM2轉谷氨酰胺酶活性導致TSS區域H3K4me3和H3K4me3Q5ser水平顯著降低。GSEA顯示，H3K4me3和H3K4me3Q5ser在參與腫瘤發生的幾個關鍵信號通路中顯著富集，包括MYC信號通路。這突出了TGM2介導的H3Q5ser修飾在HCC進展中的關鍵作用。此外，H3K4me3Q5ser修飾在PA2G4、LDHA、CCNA2、RFC4和SLC25A3的啟動子上富集。隨后，作者進行了轉錄組測序，GSEA分析顯示，GK921處理后，MYC信號通路受到顯著抑制。CUT&Tag和RNA測序的177個交集基因在所有樣本中均與H3K4me3Q5ser（或H3K4me3）峰呈正相關。 為了確定核定位的TGM2介導的H3Q5ser修飾是否影響MYC信號通路，作者在TGM2或H3.3的肝臟特異性過表達的小鼠中檢測了MYC關鍵靶基因的表達，并利用過表達野生型TGM2或突變變體（W241A）的細胞系進行了ChIP-qPCR驗證。研究發現只有具有完整轉谷氨酰胺酶活性的TGM2才會增加MYC靶基因上H3K4me3和H3Q5ser的水平。總之，這些發現表明核定位的TGM2介導的H3Q5ser修飾增強了MYC靶基因的轉錄。
圖6 H3Q5ser修飾增強MYC靶基因的轉錄 六、TRIM28介導TGM2向MYC募集，通過H3Q5ser修飾促進MYC靶基因的轉錄 為了進一步研究TGM2轉谷氨酰胺酶活性介導的H3Q5ser修飾如何調節MYC靶基因的表達，作者對MHCC-97H細胞中的TGM2進行了HuProt人類蛋白組芯片聯合MS，發現TRIM28可能與TGM2結合并利用coIP進行了驗證。分子對接結果表明，TRIM28介導了TGM2向MYC的募集，進一步的ChIP-qPCR分析表明TRIM28與MYC靶基因的啟動子結合。 MYC靶基因上的H3K4me3和H3Q5ser水平因MYC或TRIM28敲低而下調。TRIM28敲低可降低MYC靶基因的轉錄，但不下調TGM2和MYC的表達。MYC敲低不影響TRIM28和TGM2在蛋白或mRNA水平上的表達。因此，TRIM28介導了TGM2對MYC信號通路的調節。
圖7 TRIM28介導MYC募集TGM2，促進MYC靶基因上的H3Q5ser修飾 七、靶向TGM2轉谷氨酰胺酶活性在臨床前模型中抑制HCC進展 由于TGM2轉谷氨酰胺酶活性在HCC進展中起重要作用，作者探索了其作為HCC治療靶點的潛力。首先，研究確定了兩種抑制劑Cystamine和GK921對H3K4me3和H3K4me3Q5ser的抑制作用。前者是谷氨酰胺轉氨酶活性的泛抑制劑，而后者僅抑制TGM2谷氨酰胺轉氨酶活性。兩種抑制劑均在顯著劑量下抑制H3K4me3Q5ser水平，在高劑量下抑制H3K4me3水平。CCK-8實驗顯示，這兩種抑制劑在不同劑量下抑制HCC細胞增殖，且小鼠模型和人類HCC類器官模型表明GK921作為HCC治療劑具有很大的潛力。此外，GK921與索拉非尼（一種現有的HCC治療劑）有顯著的協同作用。因此，靶向TGM2轉谷氨酰胺酶活性，特別是聯合索拉非尼是一種很有前景的HCC治療策略。
圖8 TGM2抑制劑與索拉非尼協同作用 IGENEBOOK 文章總結 TMG2表達與AFP水平升高、分化不良、BCLC分期較晚呈正相關。本文通過CUT&Tag聯合RNA-seq測序技術，發現TGM2能夠向MYC基因募集，促進H3Q5ser修飾MYC靶基因從而增強HCC進展。TGM2作為預后生物標志物，靶向其轉谷氨酰胺酶活性可能是抑制HCC進展的有效策略。 CUT&Tag產品介紹 CUT&Tag是研究蛋白和DNA互作的新興實驗方法，該方法是通過蛋白特異性抗體引導Protein A-Tn5酶在目標蛋白結合的DNA位置進行切割并且在序列兩端加上測序接頭，經過PCR擴增后形成可以用于高通量測序的文庫，隨后對文庫進行測序分析從而解析與目標蛋白結合的DNA片段。 產品優勢： 1. 無需甲醛交聯，樣本要求量低，背景干凈，可重復性好； 2. 提供從方案設計，建庫測序，到數據分析和驗證一站式服務； 3. 云平臺，多組學聯合分析深度挖掘數據； 4. 項目經驗豐富：
· 實測數據：1. 抽核結果 提供“單細胞測序”標準的抽核解決方案。
2. CUT&Tag酶切片段分布 轉錄因子/組蛋白修飾的酶切片段分布呈現周期性。
3.reads密度分布圖 reads在TSS附近呈現明顯的富集。
4.功能元件分布圖 Peak在基因功能元件上分布。
5.Peak可視化 
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