在分子生物學(xué)研究中，識(shí)別和分析基因組范圍內(nèi)的調(diào)控元素是理解基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的關(guān)鍵。隨著高通量測序技術(shù)的不斷進(jìn)步，諸如ChIP-seq、ATAC-seq、CUT&Tag和DAP-seq等技術(shù)為我們提供了強(qiáng)大的工具，以揭示轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、開放染色質(zhì)區(qū)域和DNA結(jié)合蛋白的相互作用等信息。在這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中，我們常常接觸到“peak/差異Peak”的概念。從分析邏輯上來說Peak究竟是如何產(chǎn)生的？本文將探討這些問題背后的分析邏輯，主要圍繞以下四個(gè)問題幫助大家更好地理解這些高通量數(shù)據(jù)的分析結(jié)果。

A1: 首先我們來解釋下什么是peak，peak（峰）是指在基因組中發(fā)現(xiàn)的特定區(qū)域，這些區(qū)域顯示出顯著的信號(hào)強(qiáng)度，通常與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合或其他蛋白質(zhì)-DNA相互作用相關(guān)。表觀組學(xué)的研究一般會(huì)同組設(shè)計(jì)2~3個(gè)重復(fù)，MACS2軟件（圖1）進(jìn)行call peak時(shí)，會(huì)基于reads進(jìn)行建模以及均一化（方便IN和IP之間具有可比性），隨后利用泊松分布計(jì)算顯著性p值后，利用預(yù)先設(shè)置的顯著性閾值輸出peak結(jié)果文件（圖1）。除了單樣本IP VS IN的call peak，當(dāng)組內(nèi)有生物學(xué)重復(fù)時(shí)，MACS也能整合組內(nèi)重復(fù)數(shù)據(jù)輸出“以組為單位的peak結(jié)果”（圖2）。除了MACS自身分析的“組peak”外，我們還會(huì)人為對(duì)組內(nèi)生物學(xué)重復(fù)peak進(jìn)行merge peak分析，得到以第二種方式分析的“組的peak”，分析邏輯如圖3。

圖 1 MACS2分析流程

圖 2 “合并組peak”的分析邏輯

圖 3 merge peak示意圖

A2:差異peak就是要涉及到組間比較了，通常使用的分析軟件是DiffBind分析包。該軟件會(huì)對(duì)兩個(gè)不同組樣品進(jìn)行差異分析，計(jì)算peaks重復(fù)間隔的測序reads數(shù)，并基于結(jié)合親和力鑒定具有統(tǒng)計(jì)顯著性的差異結(jié)合位點(diǎn)，確定樣品間上調(diào)或下調(diào)差異修飾的區(qū)間。分析思路采用了RNA-seq中差異基因表達(dá)的方式來進(jìn)行peak的差異分析，和macs2的差異功能（bdgdiff）不同，DiffBind需要依賴已有的peak calling結(jié)果，將peak區(qū)域當(dāng)做RNA-seq中的基因區(qū)域，然后對(duì)這些區(qū)域進(jìn)行定量和差異分析，其核心的差異分析通過調(diào)用RNA-seq中常用的R包來實(shí)現(xiàn)。通常默認(rèn)的模型是DESeq2。這就意味著如果要用DiffBind進(jìn)行差異分析的話，必須要有重復(fù)樣本，否則行不通。

除了直接使用DiffBind軟件計(jì)算組間差異，還可以順著merge peak的位置信息，通過取交集的方式分析兩組樣本間的差異。

A3: Diff_anotation注釋表格（圖4）是整個(gè)差異組比較中最核心的部分:“Treat_vs_CK.merge_peak_down.peak_annotation”是利用組內(nèi)重復(fù)merge取交集后的peak再按照peak位置關(guān)系做組間比較，得到Treat與CK相比較只在CK中有富集的峰；“Treat_vs_CK.merge_peak_up.peak_annotation”是利用組內(nèi)重復(fù)merge取交集后的peak再按照peak位置關(guān)系做組間比較，得到Treat與CK相比較只在Treat中有富集的峰；

以上merge之間peak的比較只有有無的區(qū)別，沒有顯著性的統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算。

“Treat_vs_CK.down.peak_annotation”是利用DiffBind軟件（默認(rèn)是內(nèi)置DESeq2邏輯）分析組間peak差異，與merge_peak分析不同，該軟件包會(huì)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的計(jì)算，并對(duì)富集倍率有一定要求，默認(rèn)閾值為FDR值小于0.05，并且Fold（log2FC）小于0。分析結(jié)果包含F(xiàn)old、p.value、FDR、關(guān)聯(lián)靶基因等，如圖5。down是指Treat與CK相比較，在Treat中富集倍率降低的peak區(qū)域。

“Treat_vs_CK.up.peak_annotation”同樣也是利用DiffBind軟件分析的，是指Treat與CK相比較，在Treat中富集倍率升高的peak區(qū)域。

“Treat_vs_CK.mid”是樣本間所有差異的Peak的文件，老師們可以利用這個(gè)文件結(jié)果，自主利用閾值篩選；“Treat_vs_CK.nofilt”同樣也是樣本間所有差異的Peak的文件，只不過包含了注釋信息。

兩種比較方案有不同的側(cè)重點(diǎn)，merge diff側(cè)重于分析A組相對(duì)于B組的“特有peak”，而diffbind則傾向于分析兩組間固定區(qū)域的結(jié)合強(qiáng)度差異（FOLD）。因此，兩個(gè)差異方案結(jié)合，能從不同角度探究組間差異，老師可自行按照自身關(guān)注點(diǎn)來選擇以哪種結(jié)果進(jìn)行后續(xù)研究。

圖 4 Diff_anotation文件

圖 5 軟件分析表格結(jié)果

A4: 對(duì)于多重復(fù)樣本差異分析可以參考上述A3中的DiffBind軟件包或者先取組內(nèi)交集merge再做組間比較；而對(duì)于單樣本的組間比較就沒有那么多選擇了，只能通過peak位置判斷差異，取兩組間非交集的peak區(qū)域。

上述所有的分析內(nèi)容，在愛基的ChIP-seq、ATAC-seq、CUT&Tag和DAP-seq項(xiàng)目中都可以分析哦，依據(jù)分析出來的peak愛基還可以提供指定的基因/peak的reads富集峰圖，歡迎各位有相關(guān)需求的老師前來咨詢~

項(xiàng)目咨詢

• 參考文獻(xiàn)：

Zhang, Y., Liu, T., Meyer, C. A., Eeckhoute, J., Johnson, D. S., Bernstein, B. E., Nusbaum, C., Myers, R. M., Brown, M., Li, W., & Liu, X. S. (2008). Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome biology, 9(9), R137. https://doi.org/10.1186/gb-2008-9-9-r137

Stark, R., & Brown, G. (2011). DiffBind: differential binding analysis of ChIP-Seq peak data. R package version, 100, 4-3

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