低溫脅迫是影響宜昌橙（Citrus ichangensis）產量和品質的重要限制因素。近期，華中農業(yè)大學劉繼紅教授團隊在期刊Plant Biotechnology Journal（IF=10.5)發(fā)表一項研究，通過DAP-seq和RNA-seq揭示了通過調控CiCAD7介導的桔皮素生物合成和CiGSTF6依賴的ROS清除來調節(jié)抗寒性，此外，CiWRKY27還與受其調控的CiRAP2.7蛋白相互作用，形成一個關鍵的抗寒調控模塊。為深入了解低溫脅迫下桔皮素生物合成和ROS穩(wěn)態(tài)的分子調控機制提供了有價值的信息，為柑橘等作物抗寒性的改良提供了有前景的分子模型。愛基百客為該研究提供DAP-seq的技術支持。

作者首先通過亞細胞定位、酵母細胞激活報告基因表達、雙熒光素酶驗證發(fā)現(xiàn)表明CiWRKY27是具有轉錄激活活性的冷誘導的核定位蛋白。為了進一步探索CiWRKY27在耐冷性中的功能，作者在抗寒性較差的檸檬中過表達CiWRKY27基因。正常生長時，轉基因植株與野生型無差異，但在-2℃和-4℃低溫脅迫后，轉基因株系表現(xiàn)出更高的葉綠素熒光（Fv/Fm）（圖1a，b，c），同時電解質滲漏和丙二醛含量顯著降低。這些生理指標證明，CiWRKY27的過表達有效增強了檸檬的耐冷性（圖1d，e）。

圖1 過表達CiWRKY27增強轉基因檸檬的耐冷性

為了更深入地理解冷脅迫應答的分子機制并鑒定由CiWRKY27調節(jié)的靶基因，對CiWRKY27沉默（VIGS）植株與對照進行RNA-seq比較分析，揭示了該轉錄因子在冷脅迫響應中的調控網(wǎng)絡。在-4℃處理8小時后，VIGS植株中共鑒定出9911個差異表達基因（DEGs）（圖2b），其中2353個基因的表達因低溫發(fā)生顯著改變。進一步分析發(fā)現(xiàn)，這2353個基因中有1319個在其啟動子區(qū)含有WRKY轉錄因子的典型結合元件W-box，提示它們可能是CiWRKY27的直接調控靶標。功能富集分析顯示，這些潛在靶基因顯著參與“MAPK信號通路”、“植物激素信號轉導”、“晝夜節(jié)律”等關鍵生物過程。GO分析進一步表明，它們主要與“膜的內在組分”和“植物型細胞壁組織”等功能相關（圖2 e，f）。這些結果共同揭示了CiWRKY27可能通過調控細胞壁和細胞膜相關的保護性通路，在植物耐冷性中發(fā)揮核心作用。

為了進一步了解CiWRKY27介導的耐冷性的轉錄調控機制，作者用DAP-seq在全基因組范圍內鑒定了轉錄因子CiWRKY27的結合位點。測序獲得5018萬條高質量讀數(shù)，定位到18164個富集峰，對應11352個潛在靶基因。結合位點大小在165-2048 bp之間，主要富集在轉錄起始位點（TSS）附近，其中18.37%位于啟動子區(qū)（TSS上游2 kb內）（圖3a）�；�序分析發(fā)現(xiàn)了三個富集的DNA結合基序，其中最主要的基序包含WRKY家族典型識別的核心序列“TTGA(C/T)”，證實了CiWRKY27結合的特異性。KEGG分析顯示，這些靶基因顯著參與“MAPK信號通路”、“植物激素信號轉導”等與脅迫響應相關的通路。整合DAP-seq與前期冷脅迫下的RNA-seq數(shù)據(jù)，篩選出717個重疊基因（圖3d），它們很可能是CiWRKY27的直接調控靶標。作者特別關注了兩個受冷誘導且在CiWRKY27沉默植株中表達顯著下調的功能基因：谷胱甘肽S-轉移酶F6(CiGSTF6)和肉桂醇脫氫酶7(CiCAD7)（圖3f-i）。這表明CiWRKY27可能通過直接激活這些在細胞保護和抗逆中起關鍵作用的基因，來正向調控植物的耐冷性。

圖2 CiWRKY27調節(jié)基因的轉錄組譜

圖3 基于 DAP-seq 技術的CiWRKY27結合位點全基因組鑒定

基于DAP-seq數(shù)據(jù)，研究發(fā)現(xiàn)CiWRKY27在CiGSTF6和CiCAD7的啟動子區(qū)域存在顯著結合峰（圖4a，b）。為驗證其直接結合，作者進行了酵母單雜交實驗，結果表明CiWRKY27能夠與這兩個基因的啟動子片段在體內發(fā)生特異性相互作用（圖4 e，f）。同時，通過EMSA實驗證明重組CiWRKY27蛋白能夠導致含W-box的啟動子DNA片段發(fā)生條帶遷移，該遷移可被未標記的同源競爭片段劑量依賴性抑制（圖4g，h）；而將啟動子中的W-box核心基序突變后，CiWRKY27的結合能力完全喪失，證明了結合的序列特異性。最終，雙熒光素酶報告基因實驗，證實CiWRKY27的表達能顯著激活由CiGSTF6或CiCAD7啟動子驅動的熒光素酶活性，且該激活效應嚴格依賴于啟動子中完整的W-box基序（圖4 i，j，k，l）。這表明了CiWRKY27通過特異性識別并結合CiGSTF6與CiCAD7啟動子區(qū)的W-box順式作用元件，直接激活它們的轉錄表達。這兩個關鍵功能基因的上調，很可能是CiWRKY27增強植物耐冷性的核心分子途徑之一。

圖4 CiWRKY27直接結合并激活CiGSTF6和CiCAD7的啟動子

基于CiCAD7是CiWRKY27的直接靶基因，作者進一步探討了其對桔皮素合成及耐寒性的調控。與野生型相比，CiWRKY27過表達植株莖中的桔皮素積累（間苯三酚-HCl染色）、CAD酶活性及桔皮素含量均顯著增加。相反，在CiWRKY27沉默的VIGS植株中，這些指標則顯著降低（圖5）。結果表明，CiWRKY27通過上調CiCAD7的表達，促進桔皮素合成，從而增強植物的耐寒性。

圖5 CiWRKY27調節(jié)桔皮素生物合成和ROS清除促進抗寒性

作者為了驗證CiWRKY27下游靶基因的功能，研究分別構建了CiCAD7和CiGSTF6的VIGS沉默植株。耐冷性評估表明，與對照相比，這兩種沉默植株在低溫脅迫下均表現(xiàn)出更嚴重的葉片損傷、更低的葉綠素熒光（Fv/Fm）、以及更高的電解質滲漏和丙二醛含量。此外，CiCAD7沉默植株的桔皮素含量顯著降低（圖6）。結果證實，CiCAD7和CiGSTF6均正向調控植物的耐冷性，其作用機制分別與促進桔皮素生物合成和清除活性氧（ROS）相關。

圖6 CiCAD7和CiGSTF6在抗寒性的調節(jié)中起積極作用

為了闡明CiWRKY27賦予耐寒性的分子機制，作者通過酵母雙雜交篩選，鑒定出AP2/ERF家族轉錄因子CiRAP2.7是CiWRKY27的主要互作蛋白。該互作關系通過逐點酵母雙雜交、雙分子熒光互補、熒光素酶互補及體外Pull-down等多種實驗得到證實，表明兩者在體內外均直接相互作用（圖7 d）。通過進一步的功能研究，作者發(fā)現(xiàn)，CiRAP2.7能夠增強CiWRKY27的轉錄激活活性：在本氏煙草中共表達CiWRKY27與CiRAP2.7，比單獨表達CiWRKY27能更強烈地激活下游靶基因CiCAD7的啟動子（圖7 e，f）。DAP-seq數(shù)據(jù)顯示CiWRKY27在CiRAP2.7啟動子區(qū)存在結合峰（圖8a）。酵母單雜交、EMSA及雙熒光素酶報告基因實驗均證實，CiWRKY27能夠通過特異性結合CiRAP2.7啟動子中最靠近起始密碼子的一個W-box基序，直接激活CiRAP2.7的轉錄（圖8b，c，d，e）。綜上所述，CiRAP2.7不僅是CiWRKY27的互作蛋白，還受其直接轉錄調控。兩者形成了一個正向調控環(huán)路：CiWRKY27直接激活CiRAP2.7的表達，而CiRAP2.7蛋白又反過來增強CiWRKY27的轉錄活性，共同放大對下游耐冷相關靶基因（如CiCAD7）的激活信號，從而協(xié)同增強植物的耐寒性。

圖7 與CiRAP2.7的相互作用增強CiWRKY27的轉錄激活活性

圖8 CiWRKY27直接結合并激活CiRAP2.7的啟動子

作者為研究CiRAP2.7功能，通過RT-qPCR發(fā)現(xiàn)其表達受冷誘導。沉默CiRAP2.7的VIGS植株對低溫更為敏感，表現(xiàn)為更嚴重的葉片萎蔫、更低的葉綠素熒光（Fv/Fm）以及更高的電解質滲漏和丙二醛含量（圖9）。結果表明CiRAP2.7在植物耐冷性中起正向調控作用。

圖9 CiRAP2.7正調控耐寒性

該研究通過整合RNA-seq和DAP-seq的數(shù)據(jù)分析了在宜昌橙冷脅迫反應中的分子機制導致CiWRKY27的激活，其起到CiCAD7和CiGSTF6的上游轉錄激活因子的作用。CiRAP2.7與CiWRKY27相互作用并通過未知的機制增強其轉錄激活。同時，CiWRKY27轉錄調控CiRAP2.7，因此，分子模塊CiWRKY27-CiRAP2.7協(xié)同作用以調節(jié)CiCAD7和CiGSTF6，從而導致CiCAD7和CiGSTF6之間的相互作用。促進了對植物響應冷脅迫過程中桔皮素積累和ROS清除的分子機制的理解，并為探索柑橘抗寒性調控的關鍵途徑提供了有價值的線索。

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