糖尿病腎缺血再灌注損傷（RIRI）是一種嚴重的外科并發癥，糖尿病患者的預后尤其差。組蛋白甲基轉移酶G9a已被證實參與多種病理過程，但其在糖尿病RIRI中的作用尚不明確。最新證據表明，非組蛋白蛋白質甲基化可能在細胞對缺血損傷的反應中起關鍵作用。

近日，武漢大學人民醫院鄭慶源教授、王磊教授團隊在國際學術期刊Redox Biology（IF=11.9）發表題為“The G9a-TRIM21 axis exacerbates diabetic renal ischemia-reperfusion injury by inducing methylation-dependent ubiquitination and degradation of FoxO3a to promote oxidative stress and pyroptosis”的研究論文。該研究從臨床現象出發，通過RNA-seq鎖定關鍵分子 G9a；再利用Co-IP-MS、免疫組化和功能實驗等技術揭示了糖尿病腎臟缺血再灌注損傷中一種新的G9a-TRIM21-FoxO3a調控軸，其中G9a介導的甲基化修飾為FoxO3a的泛素化和降解創造了條件，從而促進了細胞焦亡和氧化應激。這些發現表明，G9a是預防或治療糖尿病腎臟缺血再灌注損傷的潛在治療靶點。愛基百客為該研究提供RNA-seq的技術支持。

研究分別從動物實驗（正常鼠 vs 糖尿病鼠）和細胞實驗分別證明糖尿病（DM）會加重腎缺血再灌注損傷（RIRI）。其中，糖尿病鼠呈現腎小管擴張、細胞脫落更嚴重；血肌酐（Cr）和尿素氮（BUN）飆升；損傷標志物（KIM1、NAGL）顯著增加。隨后，研究以RNA-seq為切入點，測序結果顯示，有一大堆蛋白甲基轉移酶的表達水平發生了顯著變化。通過KEGG和GSEA分析，發現這些差異基因主要富集在炎癥和細胞死亡通路上。這就把“甲基化酶”和“細胞焦亡/死亡”聯系起來了。研究團隊結合之前的研究和這次測序的數據，把目光鎖定在了G9a這個分子上。

圖1：DM加劇了RIRI并上調了G9a的表達。

RNA-seq結果顯示甲基轉移酶異常，研究團隊前期研究發現G9a通過抑制Sirt1促進普通RIRI。但是G9a在糖尿病環境下的RIRI中扮演什么角色？還不清楚。于是，作者進行了兩層驗證（體內+體外），構建了G9a條件性敲除（CKO）小鼠模型，細胞實驗用siRNA（干擾）或者BIX（化學抑制劑）抑制G9a。總的來說，這部分實驗結果證明抑制G9a可緩解糖尿病RIRI和氧化應激。

圖2：抑制G9a可緩解糖尿病 RIRI。

為深入G9a在糖尿病RIRI中的潛在調控機制，研究采用Co-IP- MS鑒定與G9a相互作用的蛋白質，鎖定了靶蛋白FoxO3a，并且對這些互作蛋白做KEGG分析，發現“細胞焦亡”通路顯著富集。作者用了三種不同的細胞死亡抑制劑，結果發現只有焦亡抑制劑（VX-765）能最有效地保護細胞。這說明焦亡是主導。同時，通過體內和體外實驗模型觀察發現，焦亡相關標志物NLRP3、ASC、Cle-caspase-1和IL- 1β的表達水平升高，且在糖尿病條件下其表達進一步增強。綜上，G9a在體內外糖尿病相關RIRI中均參與調控細胞焦亡。隨后，研究還做了GST pull-down證實了G9a和FoxO3a的直接互作，并確定了互作的結合區域。

圖3：G9a促進糖尿病 RIRI 細胞焦亡并靶向FoxO3a。

在糖尿病+損傷動物模型中，發現G9a升高，而FoxO3a蛋白水平顯著降低。如果敲除G9a（CKO小鼠）或者抑制G9a（siRNA/BIX），FoxO3a的蛋白水平上調。體外過表達實驗證實，G9a確實能讓FoxO3a發生甲基化。結合上一段發現的結合區域（150-300aa），數據庫預測這區域里有三個賴氨酸可能被甲基化：K230、K262和 K290。然后，研究利用點突變驗證發現K262就是那個關鍵的被G9a甲基化的位點。

鑒于G9a與FoxO3a的相互作用已被證實，研究就進一步探究了G9a如何調控FoxO3a的穩定性。研究采用自噬-溶酶體抑制劑CQ和蛋白酶體抑制劑MG132處理HK2細胞，結果表明，CQ未能維持FoxO3a蛋白的穩定性，而MG132則顯著穩定了FoxO3a蛋白。半衰期實驗顯示，G9a縮短FoxO3a的半衰期；沉默G9a促進FoxO3a的穩定性。這些結果表明，G9a通過蛋白酶體-泛素系統調節FoxO3a蛋白的表達。此外，G9a的主要功能之一是作為轉錄調節因子。研究還檢測了G9a對HK-2細胞中FoxO3a mRNA的影響，結果顯示shG9a和BIX處理均未影響FoxO3a的轉錄。綜上所述，這些發現表明，在DM相關RIRI 中，G9a通過直接在K262位點甲基化FoxO3a與之相互作用，從而促進了FoxO3a的蛋白酶系統降解。

圖4：G9a通過甲基化促進FoxO3a的降解。

進一步研究發現，糖尿病RIRI中FoxO3a的泛素化水平在體內和體外均有所增加，而G9a的缺失或沉默會降低FoxO3a的泛素化水平。然后，研究構建了各種只有單一賴氨酸的泛素突變體。結果發現，G9a主要增強的是K48-linked泛素鏈。此外，通過突變FoxO3a的甲基化修飾位點K262并將其轉染至293T細胞后，研究發現甲基化失活后FoxO3a的泛素化作用受到顯著抑制。通過生物信息學預測+點突變驗證，鎖定K176是FoxO3a接受泛素修飾的關鍵位點。結果表明，K176是FoxO3a的泛素化修飾位點。免疫熒光揭示，在G9a作用下，FoxO3a 不僅被降解，還發生了核質轉位。綜合這些研究結果，有力證明G9a在糖尿病RIRI中調控FoxO3a蛋白甲基化，從而促進FoxO3a的泛素化。

圖5：G9a促進FoxO3a在K176位點的K48連接泛素化及蛋白酶體降解。

隨后，研究利用AAV9在體內過表達FoxO3a，以探究FoxO3a在糖尿病RIRI中的關鍵作用。結果顯示，在DM + IRI組中，FoxO3a的過表達導致血清中BUN、Cr和MDA水平顯著降低，SOD含量增加，減輕了腎小管上皮細胞的組織病理學損傷，并降低了腎損傷標志物KIM1和 NAGL的表達，從而顯著減輕了RIRI中的組織損傷和腎功能障礙。WB分析表明，RIRI中FoxO3a的過表達顯著抑制了NLRP3、ASC、Cle-caspase-1和IL- 1β蛋白的表達。加上體外細胞實驗，一起提供了有力證據，表明FoxO3a能夠緩解糖尿病RIRI并誘導氧化應激。

為闡明G9a是否通過FoxO3a調控糖尿病相關RIRI，研究采用AAV9在G9a基因敲除小鼠中沉默FoxO3a。沉默FoxO3a導致血清肌酐（Cr）和尿素氮（BUN）顯著升高、腎小管擴張及上皮細胞脫落，進一步加重了腎損傷。此外，研究發現沉默FoxO3a會顯著提升腎臟損傷標志物KIM1和NAGL的表達水平，同時伴隨細胞焦亡標志物NLRP3、ASC、Cle-caspase-1及IL- 1β的上調。與此同時，FoxO3a基因沉默導致肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）和丙二醛（MDA）水平升高，同時超氧化物歧化酶（SOD）含量降低。體外細胞系實驗與體內實驗結果一致。總的來說，這部分結果為G9a-FoxO3a軸在糖尿病RIRI進展過程中促進細胞焦亡和氧化應激的潛在作用提供了證據。

圖6：FoxO3a可緩解糖尿病RIRI，并通過G9a參與驅動糖尿病RIRI。

G9a只是甲基化酶，具體負責泛素化的必然是E3泛素連接酶。研究針對TRIM家族蛋白進行了一輪IP篩選，初篩選中了TRIM21、TRIM27和TRIM231。實驗結果發現僅TRIM21能增強FoxO3a的泛素化，且泛素化位點為K176；并且抑制TRIM21可有效延長FoxO3a的半衰期。為更精確地確定TRIM21與FoxO3a的結合位點，研究再次做了截短體實驗，通過免疫共沉淀實驗，研究發現TRIM21與FoxO3a的C端（氨基酸128-475）結構域結合，并被FoxO3a在其N端（氨基酸1-148）識別。

為闡明G9a甲基化與TRIM21介導的泛素化之間的關系，研究開展了一系列全面實驗。研究結果表明，缺血條件顯著增強FoxO3a的泛素化，而這種增強效應可通過條件性敲除G9a來消除。此外，細胞實驗表明，在H/R條件下，TRIM21敲除抑制了FoxO3a的泛素化，而FoxO3a的甲基化狀態保持不變。相反，在H/R條件下，TRIM21的過表達增強了FoxO3a的泛素化。然而，G9a敲除導致的FoxO3a甲基化水平降低，同時也阻礙了TRIM21介導的FoxO3a泛素化。將野生型FoxO3a甲基化位點突變體K262R和泛素化位點突變體K176R轉染到293T細胞的實驗表明，由K262突變引起的甲基化抑制消除了泛素化。相比之下，K176R突變抑制了泛素化，但未影響FoxO3a的甲基化狀態。免疫熒光分析顯示，K262R能夠限制FoxO3a的核轉位，而K176R不阻礙FoxO3a與TRIM21的共定位。綜上所述，這些發現表明TRIM21促進了FoxO3a的泛素化，且其活性受G9a介導的甲基化調節。

該研究首次發現G9a以非組蛋白形式對FoxO3a進行甲基化，導致其發生易位，并引發由TRIM21介導的K48連接的泛素化，進而導致FoxO3a的降解。這一過程在氧化應激及糖尿病腎缺血再灌注損傷的預后中起著調節作用。這些效應與FoxO3a上的甲基化位點K262和泛素化位點K176密切相關。開發G9a抑制劑或FoxO3a激動劑對于治療糖尿病RIRI具有重要的應用前景。

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